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| Isolierung und Auftrennung von IgG’s aus Kaninchen- antiserum mittels präparativer IEF | |||||||||||||||
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Problemlösung für die: - Reduzierung der unspezifischen Immunantwort (vergleiche Abbildung1) - Erhöhung der immunologischen Signalstärke Bei der Gewinnung immunologischer Sonden in Form hochspezifischer Antikörper muß häufig das Problem unspezifischer Signale zuverlässig und reproduzierbar gelöst werden. Insbesondere bei der Untersuchung von komplexen Proteingemischen in Kombination mit nicht-aufgereinigten polyklonalen Antikörperseren sind eine Reihe von zeitaufwendigen Optimierungsversuchen notwendig, welche zum Teil letztendlich nicht zum gewünschten Erfolg führen. Abhilfe bringt die Isolierung der IgG’s über Affinitätschromatographie (Protein-A Verfahren) oder die Isolierung spezifischer IgG’s mittels Nitrocellulose geblottetem Protein. Beide Verfahren besitzen jedoch typische Einschränkungen: die Affinitätschromatographie ist für die selektive Isolierung der hochspezifischen IgG Subtypen nicht ausgelegt und die Anreicherung spezifischer IgG’s über geblottetes Protein erfordert - bei relativ niedriger Ausbeute - hochgereinigtes Antigen und optmierte Blockierungsbedingungen für die Nitrocellulosemembran. Die IgG Reinigung über selektive Fällung und präparative isoelektrische Fokussierung (IEF) stellt eine effektive Alternative dar (siehe Abb. 1), welche hohen Ansprüchen - z.B. für die Immunpräzipitation von Proteinkomplexen - genügt. Ein Beispiel für Dienstleistungen von MBBL ist diese IgG Aufreinigung aus Kaninchen-Antiserum. Das Verfahren verläuft über die selektive Ausfällung der IgG’s aus ca. 20 ml Kaninchen-Antiserum mit nachfolgender Dialyse der gewonnenen Fraktion. Nach diesem Schritt wird bereits ein deutlicher Reinigungserfolg sichtbar (siehe Abb.2A: unbehandeltes Antiserum im Vergleich mit Fraktion nach selektiver IgG Fällung). Die trägerfreie-IEF ( Prinzip ROTOFOR der Fa. BIORAD) trennt die gewonnene IgG Fraktion der selektiven Fällung in 20 Einzelfraktionen auf (Abb.2B). Nach der Dialyse der Fraktionen können die gewonnenen IgG Fraktionen im "western"-Blot getestet werden (siehe Abb.1: Beispiel einer "western"-Analyse von solubilisierten Arabidopsis Plasmamembranproteinen). Durch die Auftrennung der IgG’s nach ihrem isoelektrischen Punkt wird in geeigneten Fraktionen (Proteinausbeute ca. 5-10 mg) eine deutliche Verminderung unspezifischer Signale sowie eine Erhöhung der spezifischen immunologischen Signalstärke erzielt.
(es sind eine Reihe von Kombinationen möglich, z.B. auch bei der präp. Reinigung von rekombinanten Protein mittels IEF; die Position AL-2 muß jedoch einem Teilauftrag zugeschlagen werden) Fragen Sie nach individuellen Lösungen und ggf. Aktionspreisen !!! |
Abb.1: Immunoblot PAGE-aufgetrennter Proteine 
1. Orginal Antiserum, Endkonz. 11 mg/ ml "Blocking"-Puffer 2. IEF-Fraktion 10, Endkonz. 2 mg/ ml 3. Orginal Antiserum, Endkonz. 2 mg/ ml 4. nach selektiver Fällung, Endkonz. 2 mg/ ml 5. IEF-Fraktion 3, Endkonz. 2 mg/ ml 6. IEF-Fraktion 7, Endkonz. 2 mg/ ml (-) Abreicherung von unspezifischen Signalen, bei Verstärkung des spezifischen Signals (*) im direkten Vergleich von Orginal-Serum und IgG Fraktion  Abb.2A: M. Proteingrößenmarker 1. unbehandeltes Antiserum 2. Fraktion nach selektiver IgG-Fällung Abb.2B: M. Proteingrößenmarker 1-20. Fraktionen der präp. IEF-Auftrennung mit 1.) Frakt. vor Anoden- und 20.) Fraktion vor Kathodenkammer. Anmerkung: Für Immunpräzipitationen bzw. "western-Blots" wurden die Fraktionen 9-13 verwendet. |
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